Иммунологические анализы, такие как ИФА, обычно состоят из двух или более стадий инкубации, разделенных стадиями отмывки. Их проводят в 96- или 384-луночном планшете, который покрыт связанными антигенами или антителами.
После стадии блокировки планшет с покрытием сначала инкубируют либо с первичным антителом, либо с антигеном. Несвязанные (низкоаффинные) комплексы антиген-антитело затем удаляют с помощью нескольких стадий промывки. После чего планшет инкубируют со вторичным, конъюгированным с ферментом антителом, которое связывается с высокоаффинным комплексом антитело-антиген, прикрепленным к планшету. Планшет несколько раз промывают для удаления несвязанного антитела, и, наконец, добавляют реагент, который реагирует с конъюгированным с ферментом комплексом антиген-антитело и производит измеримый сигнал.
Существует множество субстратов используемых для обнаружения конечного комплекса антиген-антитело. Они делятся на три категории: фотометрические, хемилюминесцентные и флуоресцентные. Чтобы быть точным, термин ИФА относится к анализам, в которых используется фотометрический субстрат. Анализы с использованием хемилюминесцентного субстрата называют люминесцентным иммуноанализом, а анализы с использованием флуоресцентного, конъюгированного вторичного антитела называют флуоресцентным иммуноанализом.
Одним из ключевых шагов для оптимизации ИФА является промывка. Ее этапы необходимы для уменьшения фонового сигнала, связанного с несвязанным конъюгированным антителом, и, таким образом, для увеличения отношения сигнал/шум. Промывка между этапами гарантирует, что поддерживаются только специфические (высокоаффинные) события связывания, чтобы вызвать сигнал на последнем этапе. Недостаточная отмывка может привести к изменению и высокому фону, и, следовательно, плохим результатам. В этой статье вы узнаете, как мыть планшеты для ELISA с помощью автоматического промывателя планшетов, чтобы избежать высокого фона и больших отклонений (между планшетами и между повторяющимися лунками).
Основным параметром, влияющим на качество получаемых в ходе исследований данных, является объем промывки. Автоматические промывочные устройства (вошеры для ИФА) промывают лунки планшетов специальным раствором. Объем промывающей жидкости должен быть отрегулирован, так как слишком маленький объем оставляет часть поверхности неотмытой и значительно увеличивает фон. Количество промывающей жидкости должно быть одинаковым для каждой лунки, что обеспечивает повторяемость результатов в рамках планшета. Производители наборов для ИФА пишут объем промывки в инструкциях.
Вторым важным параметром, влияющим на эффективность, является количество циклов промывки. Как правило, чем их больше, тем ниже фон. Однако слишком большое количество повторений может снизить уровень сигнала, что затрудняет его измерение. Хорошее эмпирическое правило — повторять этап промывания три раза после каждого этапа инкубации с антителом или антигеном.
Тем не менее, производители планшетов с покрытием описывают рекомендуемое количество циклов промывки.
После промывки и аспирации в лунках планшета остается небольшое количество жидкости. Добиться уменьшения ее количества можно регулировкой высоты аспирации и изменением формы наконечников промывочной головки. Форма дна лунки имеет важное значение. Так в лунках с закругленным дном остается меньше жидкости, чем в лунках с плоским.
Лабораторное оборудование и расходные материалы для проведения иммуноферметного анализа вы можете найти на сайте www.laboratorii.com.
